Как работает гаситель в TaqMan-зондах?
Поговорим о Taq-Man зондах, а именно о таком его элементе как гаситель (Quencher). Что это такое, каким образом он тушит флуорофору при этом находясь так далеко от него, как далеко он может располагаться от флуорофоры, какие гасители бывают? На эти другие вопросы мы постараемся получить ответы.
Как известно, при распаде зонда (т.е. в результате 5’-экзонуклеазной активности полимеразы во время ПЦР) происходит высвобождение флуорофоры, грубо говоря, из-под гнёта гасителя (рис 1). В свободной форме флуорофора при поглощении определенной длины волны света переходит в возбужденное состояние. Флуорофора не может находиться в таком состоянии долго, в результате чего высвобождает фотон с меньшей длиной волны, происходит флуоресценция. Высвободив энергию, флуорофора обратно возвращается в основное состояние, т.е. в состояние покоя, когда молекула обладает минимальной энергией.
Рисунок 1. Механизм работы Taq-Man зондов.
Гаситель фактически выполняет роль успокоительного для флуорофоры или в данном случае репóртера (ударение на «о», не путать с репортёром). Конечно, поглощённая энергия, по закону сохранения энергии, не может просто так исчезнуть, поэтому гаситель преобразует её немного в другие формы, которые мы обязательно затронем, но чуточку позднее. Существует несколько механизмов, объясняющих принцип тушения флуоресценции. Рассмотрим основные из них.
Статическое тушение флуоресценции
Статическое тушение еще известна как контактное тушение и не спроста (рис. 2). Дело в том, что гаситель находится либо в непосредственной близости, либо в контакте с репортером, в результате чего происходит тушение флуоресценции. Представим, что репортер – это ваш близкий человек, который сильно разгневан в присутствии источника раздражения (UV), Вы же, гаситель, обнимаете его, в результате чего он (репортер) успокаивается и начинает игнорировать источник раздражения. То есть, гаситель и репортер образуют нефлуоресцентный комплекс в своём основном состоянии. В результате образования такого комплекса флуорофора меняет свой спектр поглощения и более не способна поглощать и входить в возбужденное состояние, флуоресценции не происходит.
Агрегация гасителя с репортером происходит, главным образом за счёт гидрофобных свойств в результате чего они легко схлопываются между собой. Плоские ароматические соединения с гидрофобными свойствами еще более усиливают статическое тушение. В то же время, при высоких температурах и в присутствие поверхностно-активных веществ стабильность такого комплекса сильно нарушается.
Динамическое тушение флуоресценции
Статическое тушение можно было бы назвать как тушение обниманием, нежели контактное. Дело в том, что динамическое тушение это тоже своего рода контактное тушение, но уже в виде прикосновения – тушение столкновением. Возбужденный флуорофор полон сил и энергии, и готов к флуоресценции, но столкнувшись с гасителем, который как вампир, полностью высасывает всю избыточную энергию из него. Поэтому такие гасители приобрели свое второе название как Тёмные Высасыватели (Dark Suckers), помимо основного – Темные Гасители, ну или можно более поэтично как Гасители Тьмы (Dark Quencher). Фактически происходит контактный перенос электронов от репортера гасителю, в свою очередь гаситель преобразует энергию в виде излучательного распада (флуоресценции), но с более низкой длиной волны, или безызлучательного распада известного как темный распад (dark decay), т.е. когда энергия рассеивается в виде молекулярных вибраций (тепла). Рассеивание тепла конечно настолько низкое что не может повлиять на температуру раствора.
FRET - Förster resonance energy transfer
Фёрстеровский перенос энергии иначе диполь-дипольный перенос энергии относят к классу динамических тушений. При этом перенос электронов очень сильно зависит от расстояния между репортеров (донором) и гасителем (акцептором). Было посчитано, что эффективность FRET обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором. Чем дальше гаситель от репортера, тем сильнее будет фоновое свечение. Максимальное расстояние гасителя от репортера в TaqMan зондах доходит до 30 нуклеотидов, но лучше ближе. Оптимальное расстояние от 9 до 18 нуклеотидов. При длинных зондах более 20 нуклеотидов уместно использовать внутренние гасители, т.е. располагающиеся внутри зонда. При использовании внутренних гасителей лучше располагать как можно ближе к 10 нуклеотиду. Почему же нельзя еще ближе или вообще сразу рядом? Дело в том, что может произойти статическое тушение, то есть проба схлопывается и образует шпильку, однако не за счет комплементарности последовательности олигонуклеотида, а за счет образования устойчивого комплекса гаситель-репортер. В результате чего эффективность гибридизации такой кривой пробы резко падает.
Рисунок 2. Статичное тушение = сильное взаимодействие флуорофоры (Reporter) с гасителем (Quencher) с образованием димера (шпильки). FRET (динамическое тушение) = слабое взаимодействие.
С точки зрения квантовой физики FRET аналогичен связи в ближнем электромагнитном поле, поскольку радиус взаимодействия намного меньше длины волны излучаемого света. В ближней области возбужденный донор испускает виртуальный фотон, который мгновенно поглощается принимающим акцептором. Эти виртуальные фотоны невозможно обнаружить, поскольку их существование нарушает сохранение энергии и импульса, поэтому FRET называют безизлучательным механизмом.
Для простоты понимания при FRET происходит в некотором роде внутримолекулярная передача электрона от донора к акцептору, как если бы TaqMan-зонд был собачкой, которая только ест (донор) и гадит (акцептор-гаситель).
Типы гасителей
Существует наиболее распространенные основные гасители для TaqMan:
1. TAMRA или тетраметилродамин
Один из первых гасителей, использовавшихся в зондах TaqMan
Это излучательный гаситель, который посредством FRET поглощенную энергию испускает в другой длине волны.
2. BHQ – Black Hole Quencher
Наиболее популярный гаситель
Как и черные дыры, такие гасители высасывают всю энергию и не испускает её в виде света, т.е. неизлучательный гаситель – non-fluorescence quencher – NFQ. Всю энергию гаситель рассеивает в виде тепла.
3. Dabcyl
Менее популярный, но часто используемый в сочетании с FAM и другими флуоресцеин-основанными репортерами.
Может гасить как в результате статического тушения, так и FRET. Лучше всего подходит для создания молекулярных маяков (Beacon probe) за счёт хороших показателей статического тушения.
______
Научный сотрудник НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ,
к.м.н. Слепцов А.А.