Как работает SYBR Green I?
Вы никогда не задумывались что такое SYBR Green I и как он работает в ПЦР? Стандартная отписка что "SYBR Green I это такой флуоресцентный краситель, который демонстрирует значительное увеличение флуоресценции при связывании с ДНК" не годится для полного понимания. Возникает масса вопросов: "почему тогда он не светится когда он не связан с ДНК?", "как он связывается с ДНК?", "что такого происходит с SYBR когда он находится в связи с ДНК, что приводит к увеличению флуоресценции?" и множество других. Давайте разбираться.
SYBR Green I
Рис 1. Химическая структура SYBR Green I.
Для справки
SYBR Green I при связывании с ДНК образует так называемый "комплекс ДНК-краситель" (DNA-dye-complex), который лучше всего поглощает синий свет с длиной волны 497 нанометров (λmax = 497 нм) и излучает зеленый свет (λmax = 520 нм).
Давайте для начала разберемся со словом "связывается". С химической точки зрения в комплексе "ДНК-краситель" отсутствует какая-либо химическая связь. SYBR Green I представитель так называемых "интеркаляторов" (в биохимии) - эта группа (в основном) плоских ароматических молекул, которые благодаря своей форме и размеру могут помещаться между парами оснований ДНК. Широко известным представителем данной группы является бромистый этидий (рисунок 2).
Рис 2. Интеркаляция бромистого этидия между азотистыми основаниями ДНК.
Как и бромистый этидий SYBR Green I также неспецифически (то есть вне зависимости от последовательности ДНК) интеркалирует в ДНК, однако за счёт своей особенной структуры он лучше всего помещается в малую борозду двуцепочечной ДНК.
Fun fact
SYBR Green I способен связываться и с одноцепочечной ДНК и РНК, но с РНК хуже всего.
Интеркаляция или встраивание SYBR Green I между основаниями ДНК приводит к сильнейшему, 1000-кратному увеличению квантового выхода - флуоресценции. Что же тогда происходит с молекулой SYBR Green I если отсутствует образование каких-либо химических связей, но при этому увеличивается флуоресценция? Можно было бы конечно подумать что ДНК выступает в роли фермента, например как работают ДНКзимы, и напротив что-нибудь отщепляет от SYBR Green I в результате чего происходит высвобождение энергии в виде кванта света, но и этого не происходит. Существует несколько объяснений данному феномену:
Стабилизация красителя
SYBR Green I встраиваясь между основаниями ДНК претерпевает конформационные изменения, которые стабилизирует его. Представим что наш краситель это белка, и пока она свободно бегает, она тратит очень много энергии, и, напротив, когда находится "в норке", она излучает спокойствием и счастьем. SYBR Green I в "свободной форме" получаемую энергию растрачивает на так называемую "безизлучательную релаксацию" (non-radiative decay), еще известную как "столкновительное опустошение", то есть энергия переходит в кинетическую форму и излучение может практически не происходить. В случае стабилизации молекулы SYBR Green I между основаниями ДНК SYBR Green I более не способен переводить энергию в кинетическую, в связи с чем происходит флуоресценция.
Защита от растворителя
В свободной форме SYBR Green I подвергается воздействию водной среды, которая может гасить его флуоресценцию. При образовании комплекса ДНК-краситель SYBR Green I имеет меньше контактов с молекулами воды, что также приводит к увеличению интенсивности флуоресценции.
Fun fact
Вязкость и состав растворителя влияет на уровень флуоресценции красителя.
Ограничение подвижности
SYBR Green I имеет несколько ароматический колец (рисунок 1), которые могут также вращаться вокруг своих связей. В свободной форме на эту подвижность также затрачивается энергия, т.е. происходит безызлучательная потеря энергии. ДНК ограничивает эту вращательную подвижность, тем самым также увеличивая квантовый выход флуоресценции.
Это наиболее известные и хорошо изученные факторы влияющие на флуоресценцию красителя при интеркаляции. Точный механизм интеркаляции и его влияние на квантовый выход SYBR Green I до сих пор являются предметом изучения и дискуссий.
Подытожим, при образовании "ДНК-SYBR Green I" комплекса увеличивается квантовый выход флуоресценции за счет стабилизации его структуры, защиты от молекул воды и ограничения его вращательной подвижности.
Ремарка:
Интересно, что, хотя SYBR Green I широко используется, исследования показали, что альтернативные красители, такие как EvaGreen и некоторые красители SYTO, могут превосходить SYBR Green I с точки зрения эффективности реакции и силы сигнала (Eischeid, 2011). EvaGreen как наиболее надежный вариант интеркаляционного красителя нашел активное применение в цифровой ПЦР, а SYBR Green I напротив, практически не используется.
Где ещё почитать об этом:
______
Научный сотрудник НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ,
к.м.н. Слепцов А.А.