О первом применение EvaGreen для цифровой ПЦР Вы можете ознакомиться здесь
Первое же применение EvaGreen показало высокую воспроизводимость и стабильность сигнала красителя (Wang, 2006). С помощью Сэнгеровского капиллярного электрофореза выявили также высокую воспроизводимость времени миграции и площади пика фрагментов двуцепочечной ДНК (дцДНК) при использовании EvaGreen по сравнению с SYBR Green I и SYBR Gold (Sang, 2006). Систематический анализ характеристик EvaGreen в условиях лабораторной жизни и вообще показал следующее (Mao, 2007):
EvaGreen более стабилен, даже при небрежном отношении (например забыли на столе, перегрели, перезаморозили) чем SYBR Green I (далее SG), который не допускает такого к себе отношения и легко скисает.
Если EvaGreen переборщить в реакционном миксе, то от этого станет не то, чтобы хуже, а даже лучше, что не скажешь относительно SG. EvaGreen известен тем, что он не ингибирует ПЦР реакцию.
К одноцепочечной ДНК у EvaGreen более прохладное отношение, чем y SG. Отсюда, благодаря практически полному отсутствию аффинности с одноцепочечной ДНК (например праймерами), EvaGreen показывает лучший показатель «отношения сигнала к шуму».
У EvaGreen нет особого предпочтения к последовательности ДНК, в отличие от SG, который всё-таки любит AT-богатые регионы, куда ему легче встраиваться.
Если вы случайно разлили, испачкались или даже попробовали на вкус EvaGreen, то не стоит особо переживать, так как он практически не проникает в клетку, что не скажешь о SG (рисунок).
Кстати говоря, SYBR Green I в отличие от EvaGreen, выходит из капель цифровой ПЦР и пачкает всё к чему может прикоснуться. Сигнал от SYBR Green I и так низкий по сравнению с EvaGreen, так он еще и портит всю микрофлюидику, в отличие EvaGreen, который стабильно находится только в каплях.
Как и SYBR Green I EvaGreen не то, чтобы связывается, а интеркалирует между азотистыми основаниями ДНК. Но, что же делает тогда EvaGreen таким уникальным?
В свободной форме димерный краситель принимает петлеобразную «неактивную» конформацию (шпильку), которая при этом не способна связываться с ДНК (рис. 4). В присутствии же ДНК происходит сдвиг равновесия от состояния шпильки к промежуточному, «открытому» случайному состоянию или состоянию связывания с ДНК.
Считается, что этот механизм, иногда называемый «механизмом высвобождения по требованию при связывании с ДНК», уменьшает фоновую флуоресценцию, а также снижает токсичность (мутагенность) красителя. Таким образом, краситель переходит из шпильки, когда он не способен испускать флуоресценцию, в активную форму с очень высоким уровнем флуоресценции за счет содержания двух флюорофор, а EvaGreen Plus содержит уже три флуоресцирующие молекулы.
Рисунок 4. Краситель EvaGreen связывается с дцДНК посредством нового механизма «высвобождения по требованию» или “release-on-demand”.
опубликовать свой пост?
