Мы ранее поговорили о том, что такое SYBR Green I, как он устроен и как он работает. Но, в цифровой ПЦР наибольшее распространение получил всё-таки EvaGreen. Чем же он так хорош, что превосходит SYBR Green I, в особенности когда дело доходит до цифровой ПЦР и как же он так устроен, сегодня об этом и поговорим.
EvaGreen — это недавно разработанный (в 2006 году) ДНК-связывающий краситель , который используется в самых разнообразных приложениях молекулярной генетики и биологии. В некотором роде, как указывает ряд источников, EvaGreen – это ДНК-связывающий краситель нового поколения (next-generation DNA-binding dye). Несмотря на то, что EvaGreen уже потихоньку становится обиходным названием, это все-таки зарегистрированное торговое название (®) от компании Biotium (США), которая и передаёт ведущим компаниям в области молекулярной биологии и генетики право синтеза и использования EvaGreen, да и не только, в своих наборах.
О первом применение EvaGreen для цифровой ПЦР вы можете ознакомиться здесь McDermott, 2013.
Первое же применение EvaGreen показало высокую воспроизводимость и стабильность сигнала красителя (Wang, 2006). С помощью Сэнгеровского капиллярного электрофореза выявили также высокую воспроизводимость времени миграции и площади пика фрагментов двуцепочечной ДНК (дцДНК) при использовании EvaGreen по сравнению с SYBR Green I и SYBR Gold (Sang, 2006). Систематический анализ характеристик EvaGreen в условиях лабораторной жизни и вообще показал следующее (Mao, 2007):
EvaGreen более стабилен, даже при небрежном отношении (например забыли на столе, перегрели, перезаморозили) чем SYBR Green I (далее SG), который не допускает такого к себе отношения и легко скисает.
Если EvaGreen переборщить в реакционном миксе, то от этого станет не то, чтобы хуже, а даже лучше, что не скажешь относительно SG. EvaGreen известен тем, что он не ингибирует ПЦР реакцию.
К одноцепочечной ДНК у EvaGreen более прохладное отношение, чем y SG. Отсюда, благодаря практически полному отсутствию аффинности с одноцепочечной ДНК (например праймерами), EvaGreen показывает лучший показатель «отношения сигнала к шуму».
У EvaGreen нет особого предпочтения к последовательности ДНК, в отличие от SG, который всё-таки любит AT-богатые регионы, куда ему легче встраиваться.
Если вы случайно разлили, испачкались или даже попробовали на вкус EvaGreen, то не стоит особо переживать, так как он практически не проникает в клетку, что не скажешь о SG (рисунок 1).
Кстати говоря, SYBR Green I в отличие от EvaGreen, выходит из капель цифровой ПЦР и пачкает всё к чему может прикоснуться. Сигнал от SYBR Green I и так низкий по сравнению с EvaGreen, так он еще и портит всю микрофлюидику, в отличие EvaGreen, который стабильно находится только в каплях.
Рисунок 1. Сравнение SYBR Green I и EvaGreen на культурах клеток. EvaGreen за счет своей структуры не проникает через клеточную мембрану живых клеток.
Как и SYBR Green I EvaGreen не то, чтобы связывается, а интеркалирует между азотистыми основаниями ДНК (более подробно об этом можно почитать здесь). Но, что же делает тогда EvaGreen таким уникальным?
Краситель EvaGreen довольно большая молекула, которая состоит из двух мономерных ДНК-связывающих красителей, связанных гибким спейсером. Для очень любопытных и любознательных, можно глянуть на патенты US7803943B2 (рис. 2) и US7776567B2 (рис. 3).
Рисунок 2. Оригинальная версия EvaGreen
Рисунок 3. Модифицированная версия EvaGreen
В свободной форме димерный краситель принимает петлеобразную «неактивную» конформацию (шпильку), которая при этом не способна связываться с ДНК (рис. 4). В присутствии же ДНК происходит сдвиг равновесия от состояния шпильки к промежуточному, «открытому» случайному состоянию или состоянию связывания с ДНК.
Рисунок 4. Краситель EvaGreen связывается с дцДНК посредством нового механизма «высвобождения по требованию» или “release-on-demand”.
Считается, что этот механизм, иногда называемый «механизмом высвобождения по требованию при связывании с ДНК», уменьшает фоновую флуоресценцию, а также снижает токсичность (мутагенность) красителя. Таким образом, краситель переходит из шпильки, когда он не способен испускать флуоресценцию, в активную форму с очень высоким уровнем флуоресценции за счет содержания двух флюорофор, а EvaGreen Plus содержит уже три флуоресцирующие молекулы.
______
Научный сотрудник НИИ медицинской генетики Томского НИМЦ,
к.м.н. Слепцов А.А.