Первой публикацией об использовании цифровой ПЦР для количественной оценки интересующей цели, в данном случае ВИЧ, была Симмондса с соавт. в 1990 году [Simmonds, 1990]. Коллектив исследователей был заинтересован в определении генетического разнообразия ВИЧ, инфицирующих лимфоциты в образцах крови ВИЧ-положительных людей, но признали, что изучение всего объема каждого образца помешает выявлению различий в последовательностях между отдельными провирусными молекулами. Проведено предельное разведение с последующей ПЦР репликонов и секвенированием положительных результатов (еще один ранний пример одномолекулярной ПЦР). Вскоре стало очевидно, что частота положительных амплификаций соответствует распределению Пуассона и, наоборот, количество целевых молекул провируса ВИЧ в исходном образце можно рассчитать по степени разведения и частоте отрицательных (или положительных) амплификаций. В оригинальной публикации описывалось предельное разведение как однонуклеарных клеток, так и молекул провируса, и таким образом документировалось количество клеток, несущих провирус ВИЧ, и количество молекул провируса на инфицированную клетку. В последующие годы группа продолжала использовать ПЦР с предельным разведением в ряде последующих исследований ВИЧ и вируса гепатита С.
ПЦР с предельным разведением была разработана также и нашей группой. Это предполагало соединение двух направлений исследований. В одном направлении исследований мы использовали генетический отбор и клонирование лимфоцитов для изучения соматических мутаций человека в локусах HPRT, сцепленных с Х хромосомой, и аутосомных HLA. Клонирование использовалось для увеличения редких мутантных клеток, статистика Пуассона использовалась для количественной оценки, а секвенирование ДНК для анализа природы отдельных мутировавших генов. Вторым направлением исследований стала разработка метода на основе ПЦР для идентификации и секвенирования перестроек и мутаций генов тяжелой цепи иммуноглобулина (IGH), которые могут служить клональными маркерами для клонов неопластических лимфоцитов при лейкемии. Было естественным шагом объединить эти два направления исследований, изолировать и секвенировать перестройки гена IGH, на момент постановки диагноза у пациента с лейкемией, синтезировать праймеры, специфичные для перестройки, и использовать эти праймеры и ПЦР с предельным разведением для количественной оценки маркерной перестройки IGH и, следовательно, количественно оценить лейкозные клетки в образцах, полученных во время лечения. Публикация, вкратце упоминающая этот метод, появилась в 1991 г. [Brisco, 1991]. Однако, признавая общую полезность этого метода для количественного определения ДНК-мишеней, мы опубликовали подробное исследование этого метода в 1992 году [Sykes, 1992]. Мы продолжили использовать ПЦР с предельным разведением для изучения различных аспектов лечения и биологии острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ). Самым важным исследованием была статья 1994 года в журнале Lancet, которая показала, что исход ОЛЛ у детей можно предсказать по уровню лейкемии после одного месяца терапии [Brisco, 1994], а решения о лечении, основанные на этой форме оценки, теперь стали частью рутинной практики определения в детской крови ОЛЛ.
ПЦР с предельным разведением являлась улучшением по сравнению с предыдущими методами, такими как конкурентная ПЦР, для количественного определения мишеней. Метод был точен, имел широкий динамический диапазон, мог обнаружить и количественно определить редкие целевые молекулы. Однако у него было два недостатка. Во-первых, это была открытая система и существовала вероятность загрязнения окружения продуктом ПЦР. Во-вторых, это была ручная система, и довольно трудоемкая. Наш протокол заключался в том, чтобы выполнить первоначальную серию ПЦР, включающую три повтора при десятикратных разведениях образца, чтобы приблизительно определить предел разведения, а затем выполнить окончательную серию ПЦР, включающую 5–10 повторов в каждой из серий трехкратных разведений. около предела разбавления. Конечную точку амплификации «все или ничего» оценивали с помощью электрофореза.
Поиск в Medline и Google Scholar с использованием терминов «предельное разведение» и «ПЦР» показал, что количество публикаций с использованием ПЦР с предельным разведением увеличилось до пика в 12 публикаций в год в 1999 году. Публикации были в основном, но не полностью, в области вирусологии, лимфоидной биологии и неоплазии, скорее всего, потому, что работники в этих двух областях с большей вероятностью были осведомлены об этом методе. Однако в период с 2000 по 2002 год годовой уровень публикаций резко упал, и после этого публикации с использованием ПЦР с предельным разведением практически исчезли. Несомненно, это произошло благодаря публикации Хейда с соавт., описывающей метод количественной ПЦР в режиме "реального времени" [Heid, 1996]. ПЦР в режиме "реального времени" представляет собой технологию с закрытой системой, технически простую в исполнении, и эти особенности устраняют два недостатка ПЦР с предельным разведением. Наша группа также перешла от ПЦР с предельным разведением к ПЦР в реальном времени, как только мы узнали о последнем.
В методе цифровой ПЦР, описанном Фогельштейном и Кинцлером, в качестве конечной точки использовалась флуоресценция, что позволяло избежать электрофореза. Таким образом, он имел преимущество перед ранее реализованным способом. Однако он все еще был несколько трудоемким и, поскольку конкурировал с ПЦР в режиме реального времени, не получил широкого распространения. Поиск в Medline и Google Scholar с использованием термина «цифровая ПЦР» показал, что уровень публикаций оставался низким, несколько публикаций в год, до 2007 года. Однако с этого года наблюдается быстрый и экспоненциальный рост числа публикаций, относящихся к цифровая ПЦР. Сначала эти публикации были преимущественно в журналах по инженерным наукам и микрофлюидике, но в течение последних нескольких лет число публикаций в биологических и медицинских журналах возросло. Столь быстрый рост количества публикаций, очевидно, обусловлен разработкой нового оборудования, которое делает цифровую ПЦР относительно простым и практичным методом.
История развития цифровой ПЦР имеет несколько общих уроков. Во-первых, это показывает ценность использования заголовка, который является одновременно описательным и запоминающимся. И «предельное разбавление», и «цифровой» носят описательный характер – «предельное разбавление» описывает процесс достижения отдельных молекул, «цифровой» описывает природу сигнала, но «цифровой» соответствует электронной природе эпохи. Во-вторых, метод несколько раз изобретался работниками, не подозревавшими о его существовании в другой области, несмотря на наличие доступных для поиска электронных баз данных. Предположительно, этот недостаток знаний возник из-за большого количества научной литературы и публикаций методов в специализированных журналах. Следствием этих общих факторов является то, что работники в одной области могут оказаться в весьма невыгодном положении, если они не знают о полезном методе в другой области, и, наоборот, перекрестное общение между работниками в разных областях может быть очень плодотворным. В третьих, история цифровой ПЦР показывает, что метод может во многом «опередить свое время» и потребовать достижений в других областях, таких как инженерия и химия, чтобы обеспечить его полный расцвет.
Наконец, какова будет будущая история цифровой ПЦР? Будет ли его использование продолжать расширяться в геометрической прогрессии? Будут ли решены проблемы стоимости и производительности? Каковы будут его преимущества и недостатки относительно ПЦР в режиме реального времени и секвенирования нового поколения? Будут ли разработаны другие цифровые или нецифровые методы обнаружения, не связанные с ПЦР? Уже сейчас цифровая ПЦР для редких мишеней может иногда выполняться с использованием современных инструментов для ПЦР в режиме реального времени, а секвенирование нового поколения используется как для анализа отдельных олигонуклеотидов, так и для количественного определения мишени. Несомненно, ближайшие годы будут не только интересными, но и продуктивными.